الاثنين، 21 نوفمبر، 2016

علم الأمصال

علم الأمصال
اختبار الراجنة البلازمية السريعة (RPR)
القاعدة
الزهري هو عدوى تناسلية مزمنة تحدث بواسطة مكروبات حية دقيقة ملتوية تسمي اللولبية الشاحبة. لأن المكروب الحي لا يمكن فحصه بالمزرعة في بيئة اصطناعية، يعتمد تشخيص مرض الزهري على اكتشاف أجسام مضادة معينة من خلال الاختبارات المصلية بالإضافة إلى النتائج السريرية.
يعتبر اختبار RPR "غير لولبي" حيث أن الأجسام المضادة المكتشفة ليست مخصصة للتصدي للولبية الشاحبة على الرغم  من أن وجودها في مصل الدم أو البلازما الخاصة بالمريض يكون مصحوبًا بشدة بالعدوى بسبب المكروب الدقيق. يتم من خلال هذا الاختبار قياس الأجسام المضادة (IgG وIgM) الناتجة كاستجابة للمواد الشحمانية التي تطلق من الخلايا المضيفة التالفة وأيضًا كاستجابة للمواد الشبيهة للبروتين الشحمي التي تطلق من خلال الجراثيم الملتوية. وتختفي تلك الأجسام المضادة بعد المعالجة الناجحة للعدوى.
يتكون اختبار RPR من مستضد VDRL معدل يحتوي على كربون جسيمائي صغير يتكتل في وجود أجسام مضادة راجنة في مصل الدم أو البلازما بما يشير إلى نتيجة إيجابية. يمكن قراءة التكتل مجهريًا. العينات غير المتفاعلة تظهر بصورة مثالية في شكل نموذج مستو غير متكتل وهو ما قد يعمل على تكوين حبات في منتصف منطقة الاختبار.
المادة
1.     كاشف مستضد الكربون
2.     عنصر التحكم الإيجابي
3.     عنصر التحكم السلبي
4.     شرائح اختبار تستخدم لمرة واحدة
5.     محراك ممص يستخدم لمرة واحدة
6.     مستوزع
7.     إبرة
8.     حاوية لجمع العينات
9.     مؤقت
10.   دوار البطاقات التلقائي (100 دورة في الدقيقة)
11.   (0.85%) محلول ملحي فسيولوجي (الاختبار شبه الكمي فقط).
12.   أنابيب اختبار لتخفيف العينة (الاختبار شبه الكمي فقط).

الإجراء
a.     الاختبار النوعي
1.     اجعل درجة حرارة جميع المستضدات والضوابط والعينات تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
2.     اسحب العينة في المحراك الممص مع توخي الحذر في عدم نقل أي من العناصر الخلوية.
3.     امسك بالمحراك الممص أعلى دائرة بطاقة الاختبار ثم اسكب قطرة واحدة (50 ميكرولتر) من العينة بحيث تسقط على بطاقة الاختبار. من المهم أن تمسك بالمستوزع في وضع عمودي أثناء توزيع العينة.
4.     قم بتوزيع العينة بالتساوي فوق دائرة الاختبار بأكملها مستخدمًا نهاية طرف المحراك الممص (العريض).
5.     قم برج القارورة المحتوية على كاشف مستضد الكربون للتأكد من المزج بشكل متساوي.
6.     قم بتوصيل الإبرة بالمستوزع. قم بسحب كمية كافية من مستضد الكربون تناسب عدد الاختبارات التي يتم إجراءها.
7.     احتفظ بالمستوزع في وضع عمودي للسماح بسقوط قطرة واحدة على العينة. لا تقم بالمزج. أعد المستضد غير المستعمل من المستوزع إلى القارورة الزجاجية.
8.     قم بالتدوير لمدة 8 دقائق ومن المفضل استخدام دوار تلقائي بسرعة 100 دورة في الدقيقة.
9.     اقرأ وحلل النتائج مجهريًا في ظل إضاءة جيدة.
b.     الاختبار نصف الكمي
1.     قم بتحضير مخففات مضاعفة للعينة من خلال العينة غير المخففة بنسبة 32:1 مستخدمًا محلول ملحي فسيولوجي. قم بالخلط جيدًا.
2.     مستخدمًا المحراك الممص قم بوضع قطرة واحدة (50 ميكروجرام) من كل عينة مخففة على دائرة بطاقة اختبار منفصلة.
3.     مستخدمًا طرف المحراك الممص (العريض) قم بتوزيع كل عينة مخففة بالتساوي على دائرة الاختبار بحيث تبدأ بالعينة المخففة الأعلى (32:1) ثم المضي إلى العينة الأخف (2:1).
4.     اتبع الخطوات بدءًا من الخطوة الخامسة في الاختبار النوعي.
5.     بعد مرور 8 دقائق من التدوير اقرأ نتيجة الاختبار ولاحظ آخر دائرة في مجموعة العينات المخففة التي تعطي نتيجة إيجابية.
6.     إذا كانت العينة المخففة الأعلى التي تم فحصها (32:1) متفاعلة واصل باستخدام مجموعة عينات مخففة أكبر من خلال تحضير مخففات مضاعفة للعينة من 32:1 إلى 512:1 مستخدمًا محلول ملحي فسيولوجي. امزج جيدًا ثم استمر بدءًا من الخطوة رقم 2 في الاختبار شبه الكمي.

التفسير
مراقبة الجودة
يوصى بتفعيل عناصر التحكم الإيجابية والسلبية مع كل دفعة من عينات الاختبار. ليكون الفحص صحيحًا، يجب أن يقدم العنصر الإيجابي المستخدم نموذجًا إيجابيًا قويًا وأن يقدم العنصر السلبي المستخدم نتيجة سلبية واضحة.
النتائج
الاختبار النوعي
النتيجة الإيجابية:
العينات التفاعلية (الإيجابية) توضح تراص متطابق يتراوح بين الطفيف (تفاعلي ضعيف) والقوي (تفاعلي). يرى التفاعل الإيجابي القوي في شكل تراص تكتلات كبيرة بمركز دائرة الاختبار. وترى التفاعلات الإيجابية الضعيفة في هيئة تكتلات صغيرة حول حافة دائرة الاختبار.
النتيجة السلبية
لا تظهر النتائج السلبية أية تكتلات. مستضد الكربون إما أن يبقى في تعليق مستوي أو يقوم بتشكيل حبة بارزة.

مظهر النتائج السلبية والإيجابية في اختبار RPR

الاختبار نصف الكمي
قد تصنف النتائج من القوي إلى غير تفاعلي ويشار إلى العيار على أنه المعيار المشترك لآخر عينة مخففة أظهرت تفاعلاً إيجابيًا.
1. تفاعلي قوي: لزنات كبيرة من جسيمات الكربون مع خلفية صافية.
2. تفاعلي: لزنات كبيرة من جسيمات الكربون متناثرة بشكل أكبر عن التفاعلي القوي.
3. تفاعلي ضعيف: لزنات صغيرة من جسيمات الكربون مع خلفية رمادية فاتحة.
4. شبه تفاعلي: تلازن طفيف لجسيمات الكربون يري بشكل نموذجي على هيئة حبة من التكتلات في مركز دائرة الاختبار أو متناثرًا حول حافة دائرة الاختبار.
5. غير تفاعلي: نموذج مستوي رمادي أو حبة من جسيمات الكربون غير المتكتلة في مركز دائرة الاختبار.
يجب تسجيل العينات المتفاعلة على أن الجسم المضاد إيجابي ويجب أن تخضع لاختبارات أخرى لتحديد وجود أو عدم وجود جسم مضاد محدد ضد اللولبيات.
التحديدات
       كما هو الحال في جميع اختبارات الراجنة قد تعطي نسبة صغيرة من النتائج الإيجابية الكاذبة. بعض الأمراض مثل كثرة الوحيدات العدوائية والجذام والذئبة الحمامية والوقس والالتهاب الرئوي الفيروسي قد تتسبب في حدوث مثل تلك التفاعلات.
       عينات اختبار RPR التفاعلية يجب أن يتم فحصها بواسطة اختبارات مصلية أخرى (مثل TPHA وFTA-abs) حيث أن التشخيص لا يجب أن يتم على نتيجة تفاعلية واحدة وذلك مع أي إجراء مصلي.
       كما هو الحال مع الاختبارات المصلية الأخرى فإن اختبار RPR لا يستطيع التمييز بين الزهري والعدوى اللولبية الممرضة الأخرى مثل الداء العليقي.
اختبار TPHA (اختبار التراص الدموي للولبية الشاحبة)
القاعدة
إن اختبارات الفحص المصلي لمرض الزهري باستخدام الكارديوليين والليستين كمستضدات تكون سهلة الأداء ولكن تكون هناك تفاعلات إيجابية بيولوجية كاذبة بشكل متكرر لأن الاختبارات تعتمد على مستضدات غير لولبية.
تستخدم كواشف TPHA للكشف عن المصل البشري للجسم المضاد للولبية الشاحبة بواسطة طريقة التراص الدموي غير المباشر. خلايا الطيور الحمراء المحفوظة تكون مغطاة بمكونات مستضدية لممراض اللولبية الشاحبة. تتراص خلايا الاختبار في وجود أجسام مضادة محددة للشاحبة اللولبية وتظهر نماذج مطابقة في هيئة صفيحات معايرة دقيقة.
يتم الكشف عن أية تفاعلات غير محددة تحدث باستخدام خلايا التحكم والتي هي عبارة عن خلايا دم حمراء طيرية غير مغطاة بمستضدات اللولبية الشاحبة.يمكن أيضًا أن يتم امتصاص التفاعلات غير المحددة باستخدام خلايا التحكم.
الأجسام المضادة للولبيات غير الممرضة يتم امتصاصها بواسطة استخلاص للولبيات رايتر الموجودة في تعليق الخلية.يتم الحصول على نتائج الاختبارات في فترة من 45 إلى 60 دقيقة ونماذج تراص الخلية تكون سهلة القراءة وتدوم لفترة طويلة.
تبن أن اختبار التراص الدموي للولبية الشاحبة (TPHA) يكون اختبارا مناسبًا ونوعيًا لتشخيص العدوى اللولبية حيث يمتاز بالنوعية والحساسية مقارنة باختبار FTA-ABS (اختبار امتصاص ضد اللولبيات التألقي). يتطلب الاختبار الحد الأدنى من الأجهزة المعملية وهو شديد البساطة في تنفيذه.

المادة
1.     خلايا الاختبار؛ كرية حمراء طيرية محفوظة وحساسة للمستضد اللولبي الشاحب.
2.     خلايا التحكم؛ كرية حمراء طيرية محفوظة
3.     مخفف.
4.     مصل عنصر التحكم الإيجابي؛ (مخفف بنسبة 1:20). هذا يعطي عيارا مكافئا هو 1/640:/2560  في الاختبار الكمي.
5.     مصل عنصر التحكم غير التفاعلي؛ (مخفف بنسبة 1:20).
6.     ممصات دقيقة لتحقيق 102575 و190 ميكرولتر.
7.     شرائح معايرة دقيقة مع وعاء على شكل حرف U.

الإجراء
طريقة وصفية
كل عينة تتطلب ثلاثة أوعية من صفائح المعايرة الدقيقة
1.     أضف 190 ميكرولتر من المخفف للوعاء 1.
2.     أضف 10 ميكرولتر من المصل للوعاء 1.
3.     باستخدام ممص دقيق، اخلط محتويات الوعاء 1 وانقل 25 ميكرولتر إلى الوعائين 2 و3.
4.     تأكد من إعادة تعليق خلايا الاختبار وخلايا التحكم تماما. أضف 75 ميكرولتر من خلايا التحكم إلى الوعاء 2. أضف 75 ميكرولتر من خلايا الاختبار إلى الوعاء 3.
5.     المس الصفيحة برفق لخلط المحتويات تمامًا.
6.     قم بالحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 45 و60 دقيقة. (ابعد الصفيحة عن الحرارة وضوء الشمس المباشر وأي مصدر اهتزاز آخر).
7.     اقرأ النتائج. تكون النتائج مستقرة لمدة 24 ساعة إذا تم تغطية الصفيحة وتم مراعاة الاحتياطات المذكورة أعلاه.

اختبار كمي
كل عينة تتطلب 8 أوعية من صفائح المعايرة الدقيقة. وضع ملصقات على الأوعية من A إلى H.
1.     أضف 25 ميكرولتر من المخفف إلى الأوعية من B إلى H.
2.     انقل 25 ميكرولتر من المصل المخفف بنسبة 1:20 من اختبار الفحص إلى الوعائين A وB.
3.     خذ 25 ميكرولتر من المصل المخفف من الوعاء B وكذلك بالتسلسل 25 ميكرولتر من الأوعية من B إلى H، مع طرح 25 ميكرولتر من المصل المخفف من الوعاء H.
4.     تأكد من إعادة تعليق خلايا الاختبار تمامًا. أضف 75 ميكرولتر من خلايا الاختبار إلى الأوعية من A إلى H. سيؤدي ذلك إلى تخفيف المصل بنسبة 1/ 80 في الوعاء A وتصل إلى 1/ 10240 في الوعاء H.
5.     قم بهز الصفيحة برفق لخلط المحتويات تمامًا.
6.     قم بالحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 45 و60 دقيقة (ابعد الصفيحة عن الحرارة وضوء الشمس المباشر وأي مصدر اهتزاز آخر).
7.     اقرأ النتائج. تكون النتائج مستقرة لمدة 24 ساعة إذا تم تغطية الصفيحة وتم مراعاة الاحتياطات المذكورة أعلاه.
الجدول 1: نتائج اختبار التراص الدموي للولبية الشاحبة (TPHA) 
النتائج 
        خلايا الاختبار خلايا التحكم
إيجابية قوية   نمط الخلايا الكامل يغطي
قاع الوعاء.
        لا يوجد زر إحكام
التراص
إيجابية ضعيفة        يغطي نمط الخلايا
حوالي 1/3 من قاع
الوعاء
        لا يوجد زر إحكام
التراص
متوسط يوضح نمط الخلايا
مركزًا مفتوحًا بشكل مميز   لا يوجد زر إحكام
التراص
سلبية  الخلايا مستقرة عند
قاع المكتنز،
وفي الوضع الأمثل مع مركز
واضح صغير.
        لا يوجد زر إحكام
التراص
غير معين *   تفاعل إيجابي تفاعل إيجابي
امتصاص غير معين
1. أضف 100 ميكرولتر من مصل الاختبار إلى أنبوب صغير ثم أضف 400 ميكرولتر من خلايا التحكم.
اخلط الوعاء ثم انتظر لمدة ساعة واحدة.
2. قم بالنبذ لمدة 15 دقيقة بمعدل 1000 دورة في الدقيقة واختبر المادة الطافية من خلال
طريقة وصفية.
ملاحظة: العينة الآن عند نسبة 1/5، يتعين أخذ ذلك في الاعتبار عند تحضير المخففات. إذا كانت النتيجة متكررة وغير معينة، يتعين اختبار العينة من خلال طريقة أخرى. على سبيل المثال  FTA-ABS.
تفسير النتائج
تفاعلات إيجابية قوية توضح بعض الثنيات الموجودة بحافة جدار الخلية.
عندما يكون وعاء الاختبار إيجابيا، يتعين مراقبة وعاء التحكم.
يتعين أن تستقر خلايا التحكم عند زر المكتنز. يتعين استخدامها كمقارنة خاصة بأنماط المصل غير التفاعلي حيث أن خلايا التحكم ستعطي أنماط مكتنز أكثر من خلايا الاختبار.
يشير التراص في وعاء التحكم إلى وجود راصات في العينة، يتعين توصيف الاختبار على أنه غير صالح. المصل الذي يعطي هذه النتيجة قد يمتص باستخدام خلايا التحكم وفق الوارد وصفه في الامتصاص غير المحدد. التفاعل المشكوك فيه مع خلايا الاختبار يتعين وصفه على أنه غير نهائي.
تعطي هذه النتيجة مستوى منخفض من الأجسام المضادة في الاختبار الأساسي المبكر للزهري واليوز.
ينبغي أولاً إعادة اختبار هذه العينة في الاختبار الوصفي ثم اختبار عينة أخرى في وقت لاحق لتحديد مدى وجود ارتفاع في العيار. ينصح أيضا بتنفيذ اختبار تأكيد آخر (FTA-ABS) لإكمال ملف مصل الاختبار.
اختبار فيدال ((اختبار تراص))
مقدمة
اختبار تراص فيدال لتشخيص الحمى المعوية، يختبر مصل المرضى مباشرة للتأكد من وجود أجسام مضادة إما بطريقة الشريحة أو طريقة الأنبوب، هذه الاختبارات إما وصفية أو شبه كمية.
اختبار الشريحة السريع يستخدم في الأساس كإجراء فحص ويكون مفيدا خاصة عندما يلزم فحص عدد كبير من الأمصال. يستخدم اختبار الأنبوب لتأكيد النتيجة الإيجابية التي حصل عليها من اختبار الشريحة.
تعتمد الدرجة التي يحدث بها التراص على تركيز المستضد وعدد الجسام المضادة الموجودة وتركيب محلول الملح ودرجة الحرارة.
قد تظهر الأمصال المأخوذة من المرضى العاديين تراصًا إيجابيًا من خلال مستضد فيدال بسبب التمنيع السابق والإصابة الماضية أو بسبب وجود أجسام مضادة مرتبطة بالمستضد أو العيار المكتشف كنتيجة للإصابة النشطة أو التمنيع الحديث.
لذا، يلزم تقييم عينتين أو أكثر يؤخذان بعد فترات زمنية تتراوح من 3 إلى 5 أيام من بداية المرض، تعتبر الزيادة التصاعدية دليلا أساسيا على الإصابة الحديثة أو التمنيع الحديث.
 عوامل حديدية
1.     المستضدات: المستضد عبارة عن خلايا بكتيرية متعذرة الحياة (سلمونيلة) في 0.5% من الملح المشبع بالفينول والصبغة.
2.     ممصات سيرولوجية، 0.2 ملليلتر مع تدرج 0.1 ملليلتر. سعة 0.1 ملليلتر
3.     شريحة تراص الفئة بقوس
4.     قضبان مطباق خشبية
5.     ملح فيزيولوجي (0.85% كلوريد الصوديوم)
6.     هزاز تدويري (إن أمكن)

الإجراء:
-       جمع العينات: اجمع من 5 إلى 10 ملليلتر من الدم في أنبوب عادي صغير دون مادة مضادة لتخثر الدم. اترك الدم حتى يتخثر لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة، يمكن حفظ المصل لفترة تصل إلى 24 ساعة في درجة حرارة 2.8 مئوية. إذا تطلب الأمر الحفظ لفترات أطول، يتعين التجميد، لا تقم بإعادة تجميد الدم الذي أذاب المصل

يتعين ترك المستضد حتى يدفأ في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامه في الاختبار.
أ - طريقة الشريحة
1-     وفر 0.08 و0.04 و0.02 و0.01 و0.005 ملليلتر من مصل الاختبار في حلقة منفصلة، باستخدام ممص 0.2 ملليلتر.
2-     قم بهز قارورة المستضد لخلط المحتويات تمامًا.
3-     أضف قطرة واحدة من المستضد على كل دائرة، اخلط المستضد والمصل، باستخدام خلالة أسنان أو مطباق لكل دائرة.
4-     قم بهز الشريحة لمدة تتراوح من 1 إلى 3 دقيقة (إجراء قفل الأدوات) أو باستخدام هزاز تدويري إن توفر.
5-     تقدر درجة التراص في كل حلقة كالتالي:
6-     التخفيف الذي يعطي قيمة تراص 2 أو أكثر هو نقطة النهاية أو العيار لهذا المصل.
ملاحظة: أدوات تخزين: طاقم فيدال، يخزن عند درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 مئوية، المستضد جاهز للاستخدام حسب تجهيزه.

عيار القياس:
العيار عبارة عن تبادل أقصى إجراءات التخفيف البالغة تراص بقيمة 2 أو أكثر

 الجدول 2 تسجيل التراص
  
درجة التراص
     100%         الخلفية واضحة تميل إلى الضبابية قليلا             4+
     75%           الخلفية واضحة تميل إلى العتمة قليلا                3+
     50%           الخلفية متوسطة العتمة                       2+
                  25%              الخلفية معتمة                         1+
     لا الجدول 3: تحديد عيار الجسم المضاد 

العيار هو أقصى درجات التراص التي تتسبب في حدوث تراص بقيمة (2) أو أكثر
المصل بالملليلتر                              التخفيف المرتبط
0.08 1:20
0.04 1:40
0.02 1:80
0.01 1:160
0.005       1:320


الجدول 4: يعرض في الجدول التالي مثال على اختبار الشريحة
نتائج اختبار الشريحة
نتيجة اختبار الشريحة
تحضير مصل، بالملليلتر
التخفيف       0.08 0.04 0.02 0.01 0.005       عيارات المصل أو نقطة النهاية الخاصة به
        1:20 1:40 1:80 1:160       1:320      
تفاعل التراص       
المصل رقم 1 ++++        ++++        ++++        ++    -       1:160
المصل رقم 2 ++++        +++  ++    -       -       1:80
المصل رقم 3 +++  ++    ++    _      _      1:80
ملاحظة:
1- إن اشتبه في وجود تراص تلقائي للمستضد (يتضح من خلال مجهر منخفض القوة)، تكون القارورة غير مستقرة ويتعين طرحها.
2- يفشل المرضى من حين لآخر في تكوين راصات للمصل

يعطي المخطط الموجود أدناه مؤشرًا تقريبيًا على أهمية عيارات المصل.
الجدول 5: مؤشر عيارات المصل المهمة

راصات المصل
المرض

راص حمي
راص فيدال
الظهور
الحد الأقصى
العيار والأهمية
حمى تيفود                   
سلمونيلة O فصيلة D
       
  من 7 إلى 10 أيام

       
    من 3 إلى 5 أسابيع     
1:80 (في مرحلة مبكرة) = اشتباه
1:160 فما فوق = اشتباه قوي
الإصابة بشبيه سلمونيلة حمى التيفود
سلمونيلة O فصيلة A
سلمونيلة O فصيلة B
       

هؤلاء الذين يعانون من استمرار الحمى والتيفود لفترات طويلة مثل أعراض الأجسام المضادة الموجودة الخاصة بالعيارات المشابهة لما ذكر أعلاه

ملاحظة:
1- الحد الأدنى من العيارات، المعرف كقيمة إيجابية لمستضد التيفود O والمستضد H ، يتعين تحديده للمناطق الجغرافية الفردية.
2- يحدث تفاعل متصالب مع كل من سلمونيلة الفصيلة d غير التيفية بالإضافة إلى السلمونيلة من فصائل أخرى
3- عيار فردي مرتفع بالنسبة إلى (O) يساوي (1:320) أو أكثر أو بالنسبة إلى H  يساوي (1:640) أو أكثر يعتبر إيجابيًا.

ليست هناك تعليقات:

إرسال تعليق