الاثنين، 21 نوفمبر، 2016

عد الخلايا الشبكية

  عد الخلايا الشبكية

مقدمة
تعتبر الخلايا الشبكية كريات حمراء يفعية؛ حيث تحتوي على بقايا الحمض النووي الريبي (RNA) الذي كان موجودًا بكميات أكبر في هيولى (خلية) الكريات السالفة غير المنواة والتي اشتقت منها تلك الخلايا الشبكية. ولدى الريبوسومات خاصية التفاعل مع بعض الأصباغ الأساسية مثل azure B أو زرقة الكريزيل اللامعة أو زرقة الميثيلين الجديدة (انظر أدناه) لتشكل رواسب الأزرق أو الأرجواني على شكل حبيبات أو خيوط.
القاعدة
عند تعريض كريات غير مفككة إلى أصباغ معينة تحتوي على عنصر الصبغ الأساسي فقط، مثل زرقة الكريزيل اللامعة أو زرقة الميثيلين الجديدة، تترسب الريبوسومات وتتلون بالصبغة لتبدو كشبكة الألياف الشبكية. وباستخدام هذه الألوان، تأخذ الكريات الحمراء لون أزرق مخضر باهت بينما تأخذ الشبكة لون أرجواني مائل للأزرق.
الأهمية السريرية
يمثل عدد الخلايا الشبكية في الدم المحيطي انعكاسًا دقيقًا إلى حد ما لنشاط الإريثروبويتين، على افتراض انطلاق الخلايا الشبكية من النقي العظمي وبقائها في الدوران طوال الفترة الزمنية الاعتيادية .
العينات 
تم منع تخثر الدم الوريدي باستخدام حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA). يمثل الخلط الشامل لعينات الدم قبل اختبارها أهمية بالغة للحصول على نتائج اختبارات دقيقة. وفي الواقع يتعين إجراء الاختبارات في غضون 6 ساعات من الحصول على العينات نظرًا لأن بعض نتائج الاختبارات قد تتغير بفعل فترات التخزين الطويلة. ومع ذلك، فالنتائج الموثوق بها بالصورة الكافية للأغراض السريرية يتم الحصول عليها عادة من الدم المخزن حتى 24 ساعة عند درجة 4 مئوية.
الأواني الزجاجية والمعدات
أنابيب حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA)، مستوزع أو ممص مكروي، أنابيب اختبار، شرائح  مسم مكروي.
الكواشف
محلول الصبغ
قم بإذابة 1.0 جم من زرقة الميثيلين الجديدة أو azure B في 1.0 ملي لتر من محلول الفوسفات متسق الضغط التناضحي المنظم درجة حموضته 6.5.
الإجراءات
ضع قطرتين أو ثلاث قطرات من محلول الصبغة في أنبوب بلاستيكي مقاس 75- × 10- ملم بواسطة ممص باستور بلاستيكي. أضف من 2 إلى 4 أحجام من عينية دم المريض غير المتخثرة في حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA)  إلى محلول الصبغة واخلطه. احتفظ بالخليط عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة. أعد تعليق الكريات الحمراء بالخلط الخفيف واجعل الأفلام على الشرائح الزجاجية بالطريقة المعتادة. وعندما تجف، افحص الأفلام دون تثبيت أو استخدام الصبغة المبينة.
يتم إضافة الحجم الدقيق للدم إلى محلول الصبغة لصبغ أمثل يعتمد على كريات الدم الحمراء (RBC). ينبغي إضافة نسبة من عينة الدم المصابة بفقر الدم تكون أكبر من نسبة العينة الطبيعية، بينما يتم إضافة نسبة أقل من عينة الدم الذي يعاني من كثرة الكريات عن نسبة العينة الطبيعية. أثناء التحضير الناجح، ينبغي صبغ المواد الخيطية الشبكية بلون أزرق غامق والكريات غير الشبكية بدرجات لون الأزرق المخضر الباهت. ينبغي عدم استخدام الصبغة المبينة مع الأفلام. استخدام الصبغة المبينة لا يؤدي إلى تحديد المواد الخيطية الشبكية بصورة أفضل، وقد يتسبب الصبغ المترسب فوق الكريات في حدوث التباس. علاوة على ذلك، فإن أجسام هاينز لن تُرى في التحضيرات الثابتة أو التي تستخدم فيها الصبغة المبينة. عند فحص التحضير الملون تحت مرحلة التباين، يتم تحديد الكريات الحمراء الناضجة و الخلايا الشبكية بصورة أفضل. وبهذا الأسلوب، من الممكن تمييز الخلايا الشبكية المتأخرة، التي تتميز بوجود بقايا من خيوط، عن الكريات التي تحتوي على أجسام مشتملة. من الممكن عمليات عد مرضية على الدم الذي يظل ساري المفعول (لا تشوبه شائبة) لمدة 24 ساعة، بالرغم من أن العد يميل إلى الانخفاض بعد فترة تتراوح من 6 إلى 8 ساعات ما لم يحفظ الدم في درجة حرارة 4 مئوية.
عد الخلايا الشبكية
يتعين اختيار مساحة فلم لإجراء العد، حيث لا تكون الكريات مشوهة ويكون الصبغ في حالة جيدة. هناك خطأ شائع يتمثل في جعل الفلم رقيق جدًا، بالرغم من أنه ينبغي أن لا تتداخل الكريات. لعد الكريات، استخدم عدسة شيئية غاطسة بالزيت ذات القدرة ×100، وإذا كان ذلك ممكناً، تقدم عينية العدسة إلى جانب غشاء مرن قابل للتعديل. إذا لم تتوفر عدسة عينية بجانب غشاء مرن قابل للتعديل، فمن الممكن إدخال غشاء مرن من الورق أو الورق المقوى مع تقطيع مربع صغير طول ضلعه 4 ملم في منتصف الغشاء المرن إلى العدسة العينية ويستخدم كبديل أقل ملائمة.
ينبغي أن يكون إجراء العد مناسبًا لعدد الخلايا الشبكية الحالية. وينبغي فحص عدد كبير جدًا من الكريات في حالة الحصول على عدد دقيق بشكل مقبول وذلك عند وجود أعداد صغيرة من الخلايا الشبكية فقط. عندما يكون العدد أقل من 10%، تكون هناك حاجة للقيام بإجراء مناسب لفحص الساحات المتعاقبة حتى يتم عد 100 خلية شبكية على الأقل بالإضافة إلى عد مجموع الكريات الحمراء في 10 ساحات على الأقل لتحديد متوسط عدد الكريات الحمراء في كل ساحة.
الحساب

  

عدد الخلايا الشبكية في الساحات n = x
  

متوسط عدد الكريات الحمراء في كل ساحة = y
  

إجمالي عدد الكريات الحمراء في الساحات n = n × y
  

النسبة المئوية للخلايا الشبكية = [x ÷ (n × y)] × 100%
  

العدد المطلق للخلايا الشبكية = % × كريات الدم الحمراء (RBC)

وهكذا، عندما تكون النسبة المئوية للخلايا الشبكية 3.3 وتكون كريات الدم الحمراء (RBC) 5 × 1012/لتر، فإن العدد المطلق للخلايا الشبكية في كل لتر يكون على النحو التالي: [3.3/100] × 5 × 1012 = 165 × 109
من الضروري انتشار مستحضر الخلايا الشبكية بشكل جيد وذلك لضمان توزيع الكريات في الساحات المتعاقبة.
عندما يتجاوز عدد الخلايا الشبكية 10%، يتعين فحص عدد صغير نسبيًا من الكريات للحصول على خطأ معياري بنسبة 10%.
العوامل التي تؤثر على الاختبار:
 من الضروري نشر مستحضر الخلايا الشبكية بشكل جيد وصبغه جيدًا. وهناك عوامل أخرى مهمة تؤثر على دقة العدد منها حدة الإبصار وصبر المراقب وجودة المسم المكروي وقدرة ميزه. يتم تنفيذ عمليات العد الأكثر دقة عن طريق مراقب واعٍ ليست لديه معرفة بمستوى الخلايا الشبكية المفترض، وبالتالي القضاء على تأثير الخطأ المنهجي الذي يتم عن وعي أو دون وعي.

التسلسل العمري لعدد الخلايا الشبكية في مجال الصحة
نطاق الخلايا الشبكية في البالغين والأطفال يساوي من 50 إلى 100 × 109/لتر (من 0.5 إلى 2.5%). وفي الرضع (الحمل، دم الحبل السري) يساوي من 2 إلى 5%.
إجراء عد خام للصفيحات لتحديد التركيز التقريبي، وإضافة كمية مناسبة من التعليق للدم المحفوظ. اخلط جيدًا لمدة 20 دقيقة، ومع الخلط المستمر، قم بالتوزيع على حاويات معقمة. قم بتغطية الحاويات وختمها. عند درجة حرارة 4 مئوية، يجب أن تتضمن عملية التحضير عمر تخزيني يتراوح من 3 إلى 4 أشهر. وقبل الاستخدام، أعد التعليق عن طريق رج الحاوية بالكامل باليد، يليها خلط ميكانيكي لمدة 15 دقيقة تقريبًا.

4.2.7 تحضير أفلام الدم على الشرائح

مقدمة
ينبغي تنفيذ أفلام الدم على شرائح زجاجية نظيفة. الأفلام التي تنفذ على أغطية زجاجية ليست لها مزايا مهمة، كما أنها غير ملائمة للممارسة المختبرية الحديثة. ومن الممكن نشر الأفلام باليد أو بواسطة ناشر أفلام آلي، والأخير إما أن يكون جهازًا مستقلاً أو مكون بعداد كريات دم آلي.
الأهمية السريرية
 تستخدم لتشخيص أمراض الدم المختلفة، مثل.....
القاعدة
 بالرغم من أنه يمكننا أن نحكم على نسب الكريات الحمراء أو الكريات البيضاء الموجودة في أنبوب دم مرسب، فإننا نحصل على  معلومات أكثر بكثير عند خلط الدم جيدًا بالإضافة إلى نشر طبقة رفيعة على شريحة زجاجية لتكوين فلم دم. ثم يتم حفظ كريات الدم من خلال تعريضها إلى ميثانول الكحول، وتعرف هذه العملية باسم التثبيت. يتم صبغ فلم الدم المثبت باستخدام خليط من أصباغ عدة بهدف التعرف على الكريات الفردية عند فحصها باستخدام مسم مكروي.
 العينات
يتم تحضير أفلام الدم من خلال عينة دم حديثة دون إضافة أي مادة تمنع تخثر الدم أو من خلال عينة دم غير متخثرة في حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA). ولا يجب استخدام عينة الدم المعالجة بالهيبارين عمومًا نظرًا لأن خصائصها الصبغية تختلف عن تلك الموجودة في عينة الدم غير المتخثرة في حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA). ومن الممكن إجراء أفلام جيدة على النحو التالي، باستخدام شرائح نظيفة، أو إذا لزم الأمر، مسح الغبار من عليها قبل الاستخدام مباشرة. وينبغي أن يبلغ قياس الشرائح 75 × 75 ملم وأن يكون سمكها حوالي 1 ملم؛ ولتحقيق الشكل الأمثل، ينبغي تجميد أحد أطرافها لتسهيل إلصاق بطاقة خاصة بها، ولكن هذه النوعية من الشرائح أكثر تكلفة.
الأواني الزجاجية والمعدات
أنابيب حمض الخليك الرباعي ثنائي أمين الإيثيلين (EDTA)، مستوزع أو ممص مكروي، ناشر، شرائح  مسم مكروي.
الكواشف
صبغ ليشمان
قم بوزن 0.2 جرام من الصبغة المسحوقة، ونقلها إلى قارورة مخروطية تتراوح سعتها من 200 إلى 250 ملي لتر. أضف 100 ملي لتر من الميثانول وقم بتدفئة الخليط حتى 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وقم بهز القارورة من آن لآخر. اترك القارورة حتى تبرد وقم بتصفيتها. وبعد ذلك فإنها تصبح جاهزة للاستعمال، ولكن سوف تتحسن قدرتها على التحمل.  للاستخدام اليومي، خزّن الصبغة في قارورة كهرمانية (نصف شفافة) ومحكمة (تحول دون دخول الرطوبة إلى الصبغة).  تُحفظ القارورة في مكان بارد (غير مثلج) ويمتنع تعرضها لضوء الشمس المباشر.
يجب الاحتفاظ بمخزون الصبغة في قارورة نصف شفافة (على سبيل المثال: كهرمانية) ومغلقة بإحكام في مكان مظلم. يجدد كل 3 أشهر أو في وقت سابق إذا تم الإشارة لذلك. للحصول على التفاعل الأمثل للون، يرى البعض أنه ينبغي ترك اللون المنتج حديثًا لمدة تتراوح من 3 إلى 5 أيام قبل استخدام.


الماء المنظم
قم بعمل 50 ملي لتر من 66 ملي مول/لتر من فوسفات سورينس المنظم لدرجة الحموضة المطلوبة إلى لتر واحد مع ماء درجة حموضتها 6.8. من الممكن تحضير منظم بديل من الأقراص المنظمة المتوفرة تجاريًا. يتم الحصول على محاليل درجة الحموضة المطلوبة عن طريق إذابة الأقراص في ماء واختبارها بواسطة مقياس درجة الحموضة.
الإجراء اليدوي
توزيع أفلام الدم
أولا يتم عمل فارشة توزيع من شريحة زجاجية ذات طرف أملس.‎ وباستخدام قاطعة الزجاج يتم كسر زاوية من الشريحة بحيث يكون هناك 15 ملم لفارشة التوزيع. يمكن استخدام فارشة التوزيع عدة مرات إلا إذا أصبحت الحافة رقيقة ولكن يجب أن يتم غسلها بالكامل وتجفيفها بين الأفلام وبعضها.
قم بوضع قطرة صغيرة من الدم على الخط المنتصف في الشريحة على بعد 1 سم من إحدى الأطراف.‎ ثم قم على الفور بوضع فارشة التوزيع أمام القطرة بزاوية تبلغ حوالي 30 درجة من الشريحة ثم قم بتحريكها للخلف بحيث يحدث اتصال مع القطرة. يجب أن يتم توزيع القطرة بشكل سريع بطول خط الاتصال. قم بتوزيع قطرة الدم بطول الشريحة عن طريق تحريك اليد تحريكًا متماسكًا. يجب عدم رفع فارشة التوزيع حتى يتم توزيع الدم بالكامل وباستخدام قطرة ذات حجم صحيح، فإن الفلم يجب أن يكون طوله 3 سم. من المهم أن ينتهي فلم الدم قبل 1 سم على الأقل من طرف الشريحة.
يتم التحكم في سمك الفلم عن طريقة التنوع في الضغط وفي سرعة التوزيع وتغيير الزاوية التي يتم من خلالها الإمساك بفارشة التوزيع. في حالات فقر الدم يتم الوصول إلى السمك الصحيح باستخدام زاوية أوسع وعلى النقيض فإن الزاوية يجب أن تكون أضيق في حالات كثرة الخلايا الحمراء بالدم. والسمك المثالي هو ذلك السمك الذي يظهر بالفحص المجهري ويكون فيه بعض من التداخل لكريات الدم الحمراء في أغلب طول الفلم. وبالنسبة لكريات الدم البيضاء فإنه يجب التعرف عليها بسهولة عبر معظم أجزاء الفلم. عند عمل الأفلام بشكل غير صحيح فإن كريات الدم البيضاء سوف يتم توزيعها بطريقة غير متساوية كما أن الخلايا الوحيدة وكريات الدم البيضاء الكبيرة الأخرى يتم دفعها باتجاه أطراف وجوانب الشريحة. إذا كانت الشريحة دهنية الملمس، فسوف يصبح الفلم غير منتظم وغير متماسك كما أن وجود غبار على السطح سوف يتسبب في حدوث بقع لطخية.
يجب أن يتم تعريض الأفلام للهواء حتى تجف.‎ في ظل وجود ظروف متسمة بالرطوبة قد تكون الأفلام عرضة لتيار هوائي دافئ (من مجفف الشعر على سبيل المثال) ولكن يجب أن يحفظ ذلك في واقية أمان ميكروبيولوجية.
وضع بطاقات أفلام الدم
يجب أن يتم وضع بطاقات الفلم على الفور بعد التوزيع.‎ قم بكتابة رقمٍ مرجعي خاص بالمختبر أو اسم المريض والتاريخ بقلم رصاص على الطرف المقوى من الشريحة أو على الفلم نفسه (الكتابة على الجزء الأكثر سمكًا والذي يكون أقل ملائمة للفحص المجهري). الملصق المكتوب بالقلم الرصاص لن تتم إزالته بواسطة الصبغ. إذا كان الملصق ورقيًا فيجب أن يتم لصقه بالشريحة فيما بعد. إذا تطلب تخزين أفلام الدم للرجوع إليها مستقبلا، فضع الملصق الورقي بطريقة تجعل من السهل قراءته عندما يتم حفظ الأفلام.
تثبيت أفلام الدم
قم بتجفيف الأفلام في الهواء.‎ اتركها لمدة 3 دقائق في المثبت ويجب أن يتم فعل ذلك دون تأخير ويجب عدم ترك الأفلام غير مثبتة مطلقًا لأكثر من ساعات قليلة. إذا كانت الأفلام يتم إرسالها إلى المعمل بواسطة البريد، فمتى أمكن يفضل تجفيفها وتثبيتها بالكامل قبل إرسالها.

ليست هناك تعليقات:

إرسال تعليق